漫谈无菌验证工作可能存在的误区

在灭菌验证工作中，常常感到某些技术人员对验证的概念存在误区。不认识这些误区，是无法把验证工作落实到位的。
误区一： 从来没有想过无菌的标准是什么。
为此，翻阅了美国药典。首先翻看的是《BIOLOGICAL INDICATORS FOR STERILIZATION》一章。文中给我们灭菌程序的要求是：The process must result in a biologically verified lethality sufficient to achieve a probability of obtaining a nonsterile unit that is less than one in a million。意思是说，灭菌程序对细菌杀活的能力必须被证实达到每一个无菌单元的染菌几率不高于百万分之一的水平，换句话说，杀菌必须达到10-6的存活几率。
如果用D值来表示，to achieve the required probability of a nonsterile unit that is less than one in a million, a minimum 12 D process is required，意思是说要达到这样的灭菌标准，最少要降低12个对数单位，也就是要达到12倍D值。至于D值的概念，众所周知，is the time (in minutes) required to reduce the microbial population by 90% or 1 log cycle (i.e., to a surviving fraction of 1/10), at a specific temperature（在一定温度下将微生物杀灭90%或使之下降一个对数单位所需的时间）。
有一种说法，我在美国药典没有找到，是从一本验证指南上翻来的，说的是：无菌制药工艺（aseptic pharmaceutical processes）一般是对不能最终灭菌的产品而言，成品染菌率不能超过千分之一。灭菌制药工艺（steile pharmaceutical processes）一般是对最终灭菌产品而言，成品的染菌率不能超过百万分之一。我赞成这样的说法，我认为这就是我们要达到的标准。
可是，如何来界定某特定的灭菌程序能达到灭菌目的呢？天底下的细菌多了去了，该不会把所有细菌的祖宗十八代都逮过来，一一做试验吧？于是，西人就选择了一些细菌家族的代表，这就是所谓的微生物指示剂。
在USP中，湿热灭菌（Moist Heat）常用的是嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus），干热灭菌（Dry Heat）常用的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis spp.）。我们常说，Fo值是在121℃下达到灭菌所需效果的时间，其实，更准确地说，应该是以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌，在121℃下达到灭菌所需效果的时间。
误区二：对验证缺乏正确的观念，开口便问灭菌温度为多少度才符合标准，可是，从来没有问过，这个标准是依据什么制订的。我可以明确地回答，正确的程序应该是，首先以经验公式为参考，帮助我们选择合适的灭菌条件，然后再通过现场验证予以确认。
既然无菌是判断灭菌程序正确与否的根本标准，那么我们当然要通过微生物指示剂验证试验来判断具体的温度是否达到灭菌要求了。USP在干热灭菌一节中白纸黑字地强调了a pyrogen challenge（热原挑战性试验）的重要性：Since dry heat is frequently employed to render glassware or containers free from pyrogens as well as viable microbes, a pyrogen challenge, where necessary, should be an integral part of the validation program。同时说明，the endotoxic substance has been inactivated to not more than 1/1000 of the original amount (3 log cycle reduction)，意即，在验证中，细菌内毒素指示剂必须下降大于3个对数值的灭活率。
我们所谓的Fo值、Fh值都是通过简化的指示剂灭菌试验，归纳得来的。也就是说，人们为了日常使用的方便，先在简化的灭菌过程中测定某特定温度于不同时间下的灭菌效果，汇编成列表，以资查询。然后，再让其他温度与该温度建立联系。因此，在日常应用中，无论给出哪个温度，我们都能通过与这个特定温度建立联系，从而换算出所需花费的灭菌时间。
如湿热灭菌的Fo值。为了便于迅速确定最为合适的Fo值，我们可以根据经验公式Fo值=D121×lgN= D121（lgNo-lgP）进行计算。此处，No是产品或指示剂的初始带菌量，P是灭菌后微生物残活概率。如果以百万分之一作为灭菌合格标准，即P=10-6，则Fo值= D121×lgNo+6× D121。
在验证时，嗜热脂肪芽孢杆菌指示剂的菌液浓度是事先标定的，并且嗜热脂肪芽孢杆菌指示剂的D121一般为1.5～3。此处假设D121为2，每个瓶子的带菌量为30，那么，lg30=1.47，Fo值=14.94。
可见，Fo值是与待灭菌物料的初始染菌水平，及其耐热参数D值有关的。如果由我来做验证，我最为关心的就是初始染菌水平No和生物指示剂D值。特别是No，同样一台烘箱，不同物料的初始染菌水平不一样，所需要的灭菌参数也不一定相同，这也就更加直观地说明了现场验证的重要性。
我们不少湿热灭菌设备一般要求达到15D以上。USP29也认为，在通常情况下，an autoclave clcle, where specified in the compendia for media or reagents, is a period of 15 minutes at 121℃, unless otherwise indicated。有些人因此就形成了一种该概念，以为15D就是一个可靠的标准了。其实，正如上文所述，这是一个很大的误解。这句话并不是说达到15D以上，就是一个可靠的标准。15D只不过是个常见的经验值而已。实际上，30D也不少见，美国药典29版有个不起眼的关于菌种保存的例子要求的就是30D：sterilize it by stem at 121℃ for  not less than 30 minutes（见Biological Indicator for Dry-Heat Sterilization, Paper Carrier一章）。此外需要强调的是，对于热稳定好的产品，最低要求是8 D，热不稳定的可以酌情处理，但必须进行严格的过程控制。无论怎样讲，验证才是解决问题的唯一手段。
又如干热灭菌的Fh值。BP1993年版规定仅以灭菌为最终目的的干热灭菌系统，必须保证其最小的Fh值大于170℃60min。可是在很多情况下干热既是灭菌又是除热原的办法。在这种情况下因为过程的最终目的是除去热原，所以需要极高的温度和较长的暴露时间。干热除热原在连续法中（如隧道灭菌除热原系统）采用的温度常常高于或等于300℃，在间歇法中（如干热灭菌柜），采用的温度常常高于或等于220℃。USPⅩⅢ版规定用于玻璃器皿除热原的系统必须保证其暴露（灭菌）温度和时间为250℃≥30min，因而能够达到使原始内毒素浓度下降三个对数值的效应。05版中国药典附录（灭菌法）提到，250℃×45min可以既除去细菌，又可以除去热原，使用的内毒素指示剂为大肠埃希菌内毒素。
为了方便确定合适的Fh值，人们对干热灭菌也提出了一个经验公式：Fh = 10（245-170/54）×45，其中，54为Z值。Z值一般有两个数值供选择，如果仅仅是为了除菌，Z取20，如果是为了除热原，Z取54。根据“250℃×45min可以既除去细菌，又可以除去热原”的事实，如果要达到除热原的目的，Fh必须大于或等于1000。按照这个公式计算下来，300℃×5分钟，330℃×1分钟，250℃×33分钟都能达到同样的除热原效果。
值得一提的是，我感觉目前国外的药典关于灭菌温度和时间的笔墨越来越吝啬。这种情况似乎在中国药典也有出现，或者说是中国药典跟风也未尝可知。关于温度和时间的论述，05版药典比00版药典要简洁多了。这是不是从一个侧面反映出，专家们逐渐地意识到这些参数都不是一刀切的，与具体的设备和待灭菌物料有关，因而也更加强调验证的重要性？ 
误区三：在意识上漠视了温度参数与其他因素的关联，尤其荒唐的是，有个别新手把灭菌温度等同为设定温度。
以隧道烘箱为例。机器仪表上的设定温度仅仅代表的是探头温度，所测得的温度与实际网带的温度并不一致，总是有些偏颇的。实际上，很有可能由于探头安装位置的不同，或者安装位置与网带的距离不同，导致探头温度与网带温度有较大差别。
此外，气流组织方式、风速、风压、网速速度、瓶子质量、排列方式等综合因素也会影响网带周围的温度，一旦这些因素的参数发生改变，网带周围的温度也会相应改变。
这就是为什么要进行热分布和热穿透验证的原因。同时，也因为以上原因，验证完之后，所有这些对温度存在影响的因素或运行参数都务必要按照验证时的状态来设置，否则，我就可能怀疑你的实际网带温度达不到灭菌要求。
误区四：清洁验证中不重视对热原的灭活。
热原不同于细菌，一两百度的温度或蒸汽处理对它都无济于事。生产过程中，热原一般通过酸碱浸泡冲洗、活性炭吸附、300多度一定时间的高温处理等手段来灭活。
但是，在某些时候，人们容易把这些常识遗忘。特别是长时间停产以后，如果不加以注意，隐患就更加明显。因为在停产过程中，细菌容易聚集繁殖，其代谢产物和尸体都带着很多热原物质，倘若我们不在清洁过程予以消灭，任何后续的除菌过滤和蒸汽灭菌都是无法补救的。